一、检测服务信息
1、检测方法：SYBR Green染料法
2、分析方法：相对定量
二、实验主要材料
1、主要仪器
2、主要试剂
三、实验操作
1、总RNA抽提
1）样品前处理
组织样本：取约100 mg样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至装有1 mL RNAiso Plus的1.5mL离心管中，振荡混匀后室温静置约5min。
2）相分离
每1mL RNAiso Plus加入0.2mL氯仿，振荡混匀15s后室温静置约3min，4℃，12000rpm，离心15min。
3）沉淀
转移水相至新的1.5mL离心管中，每1mL RNAiso Plus加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min。
4）洗涤
弃上清，每加入1mL75%的乙醇，混匀后4℃，7500rpm，离心5min。
5）溶解
弃上清，空气干燥RNA沉淀约5min（注意不要完全干燥，只需沉淀泛白即可），加入适量的DEPC处理水溶解RNA沉淀。
6）测定浓度和纯度
用分光光度计测定RNA浓度和纯度后记录数据。
2、反转录反应
1）按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。
2）按如下程序进行反转录：
37℃,15min；85℃，5sec。
-20℃保存备用！
3、定量PCR检测
1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。
2）冰上配制下表中的反应液
3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
4）采用三步法程序进行反应：
四、相对定量△△Ct分析原理和方法
1、荧光信号理论方程
Rn = RB X0 (1 E)n Rs
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度RS)与分子数目的乘积。
或总信号=本底信号 分子数量´单位信号强度
其中，Rn为第n个循环时的总信号，RB为本底信号，RS为单位信号强度，X0为起始模板数量，E为PCR效率。
2、公式推算
当循环次数n=Ct值时，假设E=100%时：
RCt=RB X0×2CtRs
X0×2Ct=(RCt-RB)/Rs=b
X0=b/2Ct=b×2-Ct
3、内参基因均一化样本差异
每个样品都检测目的基因和内参基因，用内参基因做均一化处理，校正各样品在核酸数量上的差异，校正值=目的基因/内参基因，即X1/X2=2-(Ct1-Ct2) =2 -△ Ct
2 -△ Ct即表示为每个样品中目的基因经过均一化处理后的分子数量。
4、处理样品和对照样品比较
比较不同样品间某个基因的表达量差异，相对值=处理样品/对照样品
即倍数变化为2 -△ Ct1/2 -△ Ct2 = 2 – △ △ Ct
五、实验结果
实验原始数据见文件夹“原始数据”；引物信息、上机排版及检测结果详见提供的Excel表格“检测结果”。
检测结果
六、项目内容
公众号：如期生物
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